林业科学

作者：张磊,胡建军*

单位：林木遗传育种国家重点实验室 国家林业和草原局林木培育重点实验室 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091

关键词：欧洲黑杨,抗虫基因,BtCry1Ac')">BtCry1Ac,转基因,hiTAIL-PCR,侧翼序列,事件特异性检测

基金：转基因生物新品种培育重大专项(2018ZX08020002);国家自然科学基金项目(32071797);国家自然科学基金项目(31570669);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFYBB2017ZY008)

目的: 分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点，从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息，推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。方法: 以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料，使用高效热不对称交错PCR法（hiTAIL-PCR）分离外源基因插入位点侧翼序列，比对毛果杨基因组序列确定插入位点。根据插入位点处的侧翼序列设计2对特异性PCR检测引物，建立转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因特异性PCR检测方法，并利用实时荧光定量PCR技术分析插入位点周边基因表达情况。结果: PCR及半定量PCR结果表明，转基因欧洲黑杨株系的BtCry1Ac基因稳定表达。通过比对毛果杨基因组序列确定转基因杨n12 T-DNA插入基因组Chr15的10162773位点即Potri.015G076600第2个内含子，其碱基组成AT含量为65%；n222整合位点为基因组Chr01基因间隔区41596184位点，其碱基组成AT含量为69%。特异性PCR检测显示，n12能扩增出709 bp（转基因）和1 159 bp（非转基因）特异性条带，n222及其与丹红杨杂交子代能扩增出1 265 bp（转基因）和1 827 bp（非转基因）特异性条带，而对照仅能扩增非转基因特异性片段。n12 T-DNA插入造成插入位点的丝氨酸蛋白激酶（SPK）Potri.015G076600基因表达量上调4.3倍，而附近的共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）Potri.015G076700表达量下调20倍，从而可能调节杨树生长速度。n222插入位点上下游基因异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷6″-O-丙二酰转移酶（IBG）Potri.001G395700和光敏色素互作因子解旋酶（PIF）Potri.001G395800表达量均上调。结论: 转BtCry1Ac欧洲黑杨T-DNA偏好插入富含AT区域，同时T-DNA载体边界序列缺失，并引起插入位点附近基因表达量变化。建立转BtCry1Ac欧洲黑杨特异性检测方法，为转BtCry1Ac欧洲黑杨的管理与监测提供参考。

来源：2020年第10期

《林业科学》期刊编辑部

查看林业科学杂志2020年第10期